DNA電泳常見問題

1. TAE與TBE各自分離范圍

       TAE緩沖液推薦用于分析分子量大于1500 bp DNA片段和超螺旋DNA條帶；TBE緩沖液推薦用于分析分子量小于1500 bp DNA片段和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。大片段DNA分子在TBE緩沖液中不能完全分離。 

2. 電泳凝膠

正確的凝膠濃度對DNA Marker的優化分離非常重要。DNA Marker中分子量偏小的較精確分離型DNA Marker（例如DL1003等）一般選擇高濃度凝膠，比如瓊脂糖凝膠濃度選擇在1.5%-3%之間；而較大分子量的DNA Marker（例如DL10004等），瓊脂糖凝膠濃度一般選擇在0.7%-1.5%。

制備凝膠的緩沖液要和電泳緩沖液保持一致，此外一定要在凝膠完全凝固后再拔去梳子。

3. 電泳條件

       電泳時，電壓建議為5-8 V/cm。電壓過低會導致條帶彌散。電壓過高會使凝膠過熱和DNA變性，還可能出現條帶彎曲等帶型。條帶較多的DNA Marker如DL0502，DL10004等一般選擇低電壓，建議為5-6 V/cm。  

      電泳緩沖液不宜太陳舊，應該定期更換；電泳時，凝膠盡量放電泳槽中間，在電泳槽兩邊可能導致條帶傾斜。

4. DNA Marker放置條件

DNA Marker較頻繁使用的可以室溫或4℃放置，否則可以-20℃保存。

5. DNA條帶出現彌散，彎曲等不規則帶型 

DNA Marker條帶出現彌散或者涂抹，可能原因有DNA降解，電泳時間過長、電壓過低、過量染色和脫色、紫外拍照時間過長。

DNA 條帶出現彎曲、月牙形狀以及鋸齒狀等不規則帶型，可能為電壓過高，上樣量太多、凝膠沒有溶解好、凝膠沒有完全凝固、膠孔質量差、成分中含有雜質如蛋白質、樣品中鹽濃度與緩沖液鹽濃度存在較大差異等等。

6. 電泳時Marker前端條帶容易變弱或是丟失 

常用染料如溴化乙啶（EB）等帶正電荷，而核酸帶負電荷，電泳過程中溴化乙啶（EB）遷移方向與核酸相反并且兩者結合不是十分牢固，導致凝膠前端結合核酸的溴化乙啶（EB）脫落并向凝膠后端遷移，從而前端條帶顯得較弱或是丟失。一般電泳時溴酚藍遷移到凝膠長度2/3及可停止。

7. 凝膠濃度影響電泳分離效果

條帶多數由小于1500 bp DNA片段組成的DNA Marker一般選擇高濃度凝膠，瓊脂糖凝膠濃度建議在1.5%-3%，而條帶多數由大于1500 bp DNA片段組成的DNA Marker一般選擇低濃度凝膠，瓊脂糖凝膠濃度建議在0.7%-1.5%。

                                               圖1                                圖2           

      在以上兩幅圖中，圖1和圖2為同樣的一種DNA Marker（條帶多數由小于1500 bp DNA片段組成）在相同電泳條件和電泳時間，不同凝膠濃度的電泳結果。

圖1瓊脂糖凝膠濃度為0.8%

        圖2瓊脂糖凝膠濃度為2%。結果顯示出在濃度為0.8%的凝膠中很難達到較好的分離效果。

8. 電泳出現樣品滯留在點樣孔

    DNA結合蛋白(如連接酶、磷酸酶、限制酶等)改變DNA的凝膠遷移率，可能導致DNA停留在點樣孔處；上樣量過多、DNA降解或是膠孔質量較差等也都有可能出現滯留在點樣孔現象。

如上圖：M: DNA Marker DL2503  1和2泳道出現滯留膠孔現象

9. 樣品條帶與DNA Marker條帶相比，出現比實際大小偏大現象

DNA的遷移不僅僅與其實際大小有關系，與是否結合有蛋白、離子狀態、DNA的結構、凝膠結構等都有關。在電泳時，單個樣品條帶的大小與DNA Marker相比，會出現偏大幾十bp之多。

10. 鹽濃度對電泳影響

電泳時的鹽濃度影響DNA的帶型。配膠的緩沖液和電泳緩沖液最好為同時配置，電泳槽中緩沖液要及時更換，樣品及Marker中的上樣Buffer要盡量保持一致。電泳出現不規則條帶，可能需要考慮鹽濃度問題。如果是樣品中鹽分過多，有必要進一步的純化。