T載體克隆常見問題
1. 連接體系中T載體和PCR片段的含量
一般市場上各種T載體的包裝濃度為20-50ng/ul。常規3kb左右的T載體在連接體系中加入總量為50ng-100ng,載體和片段摩爾比一般為1 :3。比如,一個500bp片段連接到3kb的T載體中,T載體加入量60ng,則500bp片段應該為30ng。
2. PCR片段的質量
連接體系中PCR片段的質量對連接成敗起著關鍵作用。
1)PCR片段的長度不同對連接的要求也不同,過長或是較短的PCR片段需要調整連接體系;
2)PCR片段的純度和特異性要較高;
3)回收后的PCR片段濃度要合適,特別是長度較長的片段,濃度不能過低,PCR產物做膠回收會降低片段濃度。
3. 平板沒有菌斑或是很少
收到T載體后,一般要-20℃保存。如果短期內不能使用完,建議將載體分裝保存。在室溫或是4℃放置過久,T載體會出現末端T丟失,載體降解等情況。
平板沒有菌斑或是很少,除T載體損壞外,其它原因有:
1)連接體系中的連接酶及Buffer;
2)末端含A的PCR片段質量,包括純度、濃度以及特異性;
3)感受態細胞的質量
4. 連接長度較短的PCR片段時,會出現菌斑過多,或是過少的情況
在同樣總量的情況下,DNA片段長度越短,其摩爾數就會越多,這也是許多小的PCR片段容易連接,長出更多菌斑的原因。如果DNA片段摩爾數過多,就會競爭結合有限的T載體,導致連接效率降低,反而會使菌斑降低。所以,對于連接該類片段時,其摩爾數不能過多。
5. 連接長度較長的PCR片段時,常會出現菌斑較少或不長斑等情況
常規連接時,當PCR片段長度大于2kb時,一般菌斑就會出現下降趨勢。PCR片段長度越大,菌斑就會越少??梢酝ㄟ^以下方法調試:
1)延長連接時間;
2)提高載體和片段的質量,比如,片段要為特異性單一條帶,片段不能有降解趨勢,載體和片段的純度和濃度要高;
3)可以嘗試調整載體和片段摩爾比,比如調整為1 :1等。