全基因合成常見問題(二)
Q12. 什么樣的基因是復雜基因?
低GC含量序列:低GC含量的基因序列一般是指全長GC含量低于20%的基因,或100bp以內GC含量少于10%的序列;對于低GC片段,不包含發卡結構、反義互補、重復等其它復雜結構,一般將其分割成200bp/段來合成,然后通過合適的內切限制酶酶切后連接(常用BsaI和BpiI,所以序列本身最好不含有這兩種酶切識別序列),這樣更易得到正確的克隆,但是發貨期將比正常序列更長一些,而且價格也比常規基因稍貴。一般低GC序列都可以合成并可通過測序驗證。
高GC含量:高GC序列一般是指GC含量高于70%的序列或100bp以內GC含量高于80%的序列;與低GC序列不同,高GC序列難于測序,所以GC>75%的序列合成業務,請特別詢價,對于此類序列也需要將其分割成300bp的片段來合成,需要合適的內切限制酶,如BsaI 和 BpiI。
反義互補重復序列:由于此類結構序列也不易于測序,所以我們一般不不承接反義互補重復序列合成業務。
復雜基因與常規基因相比,合成費用較高,合成時間相對延長。對于復雜基因,可通過密碼子優化,盡量減少基因序列中的重復序列,高GC%區和二級結構區。
Q13. 客戶收到的基因為什么質粒切不動,或切不全?
可能原因如下:
(1) 質粒上酶識別序列不正確或者沒有;
(2) 酶切反應條件不合適;
(3) 限制性內切酶對DNA甲基化敏感;
(4) 內切酶稀釋不正確或加入方法不正確;
(5) 甘油濃度過高;
(6) 限制性內切酶已部分或全部失活;
(7) 保護堿基引入導致側翼鏈鎖死酶切位點。
對策:
(1) 檢查質粒DNA中是否存在可被限制酶識別的DNA序列。
(2) 優化酶反應體系,使用隨酶提供的反應緩沖液;增大酶量或更換新酶。
(3) 檢查DNA是否已被甲基化,所用的酶是否對甲基化敏感。
(4) 更換保護堿基,或PCR擴增目的片段,酶切PCR產物。
Q14. 如何運輸以及保存質粒及其菌株?
我們為您提供含有完全正確的基因序列的質粒(不少于5ug)兩管。質??沙剡\輸,溶解后需-20℃保存,并盡量避免反復凍融。
Q15. 客戶提供樣品做相關服務時,送樣要求有哪些?
質粒樣品,可以是穿刺菌、甘油菌、凍干質?;蛸|粒溶液等形式。
(1) 穿刺菌:請提供穿刺培養的單克隆菌落。穿刺培養的菌可以長時間保存而不會導致質粒的拷貝數明顯下降。樣品請在1.5ml或2ml的Eppendorf管中加入相應抗生素的固體LB培養基,然后將單菌落用牙簽穿刺于LB固體培養基中。
(2) 菌液:請將過夜培養的菌液加滅菌甘油至終濃度20%保存于1.5ml或2ml的Eppendorf管中,注意封口,以免污染。
(3) 質粒:請提供3-5ug溶于無菌去離子水的質粒溶液或者抽干質粒。
(4) 注意:
a.請將裝有樣品的Eppendorf 管口用封口膜封緊,防止運輸途中開蓋導致樣品污染或者丟失。
b.請在管壁上注明質粒名稱及抗性。
c.載體其他信息請以郵件或便簽等形式告知。