全基因合成常見問題（二）

Q12. 什么樣的基因是復雜基因? 

    低GC含量序列：低GC含量的基因序列一般是指全長GC含量低于20%的基因，或100bp以內GC含量少于10%的序列；對于低GC片段，不包含發卡結構、反義互補、重復等其它復雜結構，一般將其分割成200bp/段來合成，然后通過合適的內切限制酶酶切后連接（常用BsaI和BpiI，所以序列本身最好不含有這兩種酶切識別序列），這樣更易得到正確的克隆，但是發貨期將比正常序列更長一些，而且價格也比常規基因稍貴。一般低GC序列都可以合成并可通過測序驗證。

    高GC含量：高GC序列一般是指GC含量高于70%的序列或100bp以內GC含量高于80%的序列；與低GC序列不同，高GC序列難于測序，所以GC>75%的序列合成業務，請特別詢價，對于此類序列也需要將其分割成300bp的片段來合成，需要合適的內切限制酶，如BsaI 和 BpiI。

    反義互補重復序列：由于此類結構序列也不易于測序，所以我們一般不不承接反義互補重復序列合成業務。

    復雜基因與常規基因相比，合成費用較高，合成時間相對延長。對于復雜基因，可通過密碼子優化，盡量減少基因序列中的重復序列，高GC%區和二級結構區。

Q13. 客戶收到的基因為什么質粒切不動，或切不全?

    可能原因如下：

    (1) 質粒上酶識別序列不正確或者沒有；

    (2) 酶切反應條件不合適；

    (3) 限制性內切酶對DNA甲基化敏感；

    (4) 內切酶稀釋不正確或加入方法不正確；

    (5) 甘油濃度過高；

    (6) 限制性內切酶已部分或全部失活；

    (7) 保護堿基引入導致側翼鏈鎖死酶切位點。

    對策：

    (1) 檢查質粒DNA中是否存在可被限制酶識別的DNA序列。

    (2) 優化酶反應體系，使用隨酶提供的反應緩沖液；增大酶量或更換新酶。

    (3) 檢查DNA是否已被甲基化，所用的酶是否對甲基化敏感。

    (4) 更換保護堿基，或PCR擴增目的片段，酶切PCR產物。

Q14. 如何運輸以及保存質粒及其菌株?

    我們為您提供含有完全正確的基因序列的質粒（不少于5ug）兩管。質?？沙剡\輸，溶解后需－20℃保存，并盡量避免反復凍融。

Q15. 客戶提供樣品做相關服務時，送樣要求有哪些？

     質粒樣品，可以是穿刺菌、甘油菌、凍干質?；蛸|粒溶液等形式。

    (1) 穿刺菌：請提供穿刺培養的單克隆菌落。穿刺培養的菌可以長時間保存而不會導致質粒的拷貝數明顯下降。樣品請在1.5ml或2ml的Eppendorf管中加入相應抗生素的固體LB培養基，然后將單菌落用牙簽穿刺于LB固體培養基中。

    (2) 菌液：請將過夜培養的菌液加滅菌甘油至終濃度20%保存于1.5ml或2ml的Eppendorf管中，注意封口，以免污染。

    (3) 質粒：請提供3-5ug溶于無菌去離子水的質粒溶液或者抽干質粒。

    (4) 注意：

     a.請將裝有樣品的Eppendorf 管口用封口膜封緊，防止運輸途中開蓋導致樣品污染或者丟失。

     b.請在管壁上注明質粒名稱及抗性。

     c.載體其他信息請以郵件或便簽等形式告知。