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            引物合成常見問題

            作者:上海捷瑞生物工程有限公司 瀏覽: 發表時間:2020-02-26 00:00:00

            引物合成常見問題

            1.引物是如何合成的?

            目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種,無論采用什么機器合成,合成的原理都相同,主要差別在于合成產率的高低,試劑消耗量的不同和單個循環用時的多少。

            1) 去保護:加入Deblocking脫去堿基上5'- OH的保護基團 DMT ,獲得游離的 5'- OH; 

            2) 耦合:同時加入活化劑和新的堿基,新的堿基 5'- OH仍然被 DMT 保護,3' 端被活化與溶液中游離的 5'- OH發生耦合反應;

            3) 封閉:耦合反應中極少數 5'- OH沒有參加反應 ,用封閉試劑終止其后繼續發生反應;

            4) 氧化:加入氧化劑使其由核苷亞磷酸酯形成更穩定的核苷磷酸酯。

            合成后處理:

            切割與脫保護基:將合成好的寡核苷酸鏈從支持物上化學切割下來。常用新鮮的濃氨水來裂解CPG與初始核苷之間的酯鍵。斷裂下來的寡核苷酸帶有自由的3’羥基。

            純化:根據所合成寡核苷酸的組成和應用來選定純化的方法。常用的純化方法有:C18、OPC、PAGE和HPLC。

            定量:根據寡核苷酸在260nm處的紫外吸收來定量。

            儲存:分裝抽干。

            2.引物純化方式有哪些,如何選擇?

            ◆ C18柱脫鹽:又稱簡易反相柱,它對DNA有特異性的吸附,可以被有機溶劑溶解洗脫,但不會被水洗脫,所以能有效地去除鹽分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。實際上,它是一種脫鹽的作用。這種方法一般不會對普通PCR反應產生影響。對于需要用于測序、克隆的引物不能使用這個級別。    

            ◆ OPC純化: OPC純化是根據DNA保護基(DMT基)和樹脂間的親合力作用的原理進行純化目的DNA片段。OPC法純化的DNA純度大于95%。適用于45base以下引物的純化。

            ◆ PAGE純:  PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,對DNA片段進行分離,然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法,純化后的DNA純度大于95%,對長鏈Oligo DNA (大于45mer)的純化特別有效。 

            ◆ HPLC純化:HPLC純化是使用高效液相色譜的原理,對DNA片段進行純化。純度可以大于99%。主要用于短鏈和修飾引物的純化。該法的弱點是成本較高,批量生產效率不高。

            ◆ F-PAGE純化:利用高分子惰性聚合分子作為合成載體,合成縮合率較高,有效減少了失敗條帶。經過后續的脫鹽實驗,能夠去除銨鹽等雜質,適用于大部分實驗要求。F-Page純化具有合成效率及純度高,合成時間更短等顯著特點。

            3.合成的引物5’端是否有磷酸化?

            合成的引物5’為羥基,沒有磷酸基團。如果需要您可以用多核苷酸激酶進行5’端磷酸化,或者要求我們合成時直接在5’或3’端進行磷酸化,需要另外收費。

            4.需要什么級別的引物?

            答:根據實驗需要,確定訂購引物的純度級別。

            應用

            引物長度要求

            純度級別要求

            一般PCR擴增

            < 45base

            OPC,F-PAGE


            >45 base

            PAGE

            診斷PCR擴增

            < 40base

            OPC,F-PAGE,PAGE

            DNA測序

            20base左右

            OPC,F-PAGE

            亞克隆,點突變等

            根據實驗要求定

            OPC,F-PAGE,PAGE,HPLC

            基因構建(全基因合成)

            根據實驗要求定

            PAGE

            反義核酸

            根據實驗要求定

            PAGE

            修飾引物

            根據實驗要求定

            PAGE, HPLC

            5.需要合成多少OD數?

            答:根據實驗目的確定。一般PCR擴增,2 OD引物,可以做200-500次50ul標準PCR反應。如果是做基因拼接或退火后做連接,1 OD就足夠了。

            6.如何計算引物的濃度?

            答:引物保存在高濃度的狀況下比較穩定。一般情況下,我們建議將引物的濃度配制成100pmol/ul,稱為保存濃度,而引物的工作濃度一般配制成10-50pmol/ul。加水的體積(微升)可直接參照合成報告單上推薦的體積,也可按下列方式計算:

            V (微升)= OD數x 33 x 10000 /引物的分子量

            引物的分子量可以從合成報告單上獲得。注意:1 OD260= 33 ug/ml。 

            溶解前您需要核對合成報告單和引物標簽上的引物OD數是否一致。如果不一致,請和我們聯系。我們可以根據生產記錄查到實際產量是多少。

            7.如何計算引物的Tm值?

            答:引物設計軟件都可以給出Tm,與引物長度、堿基組成及所使用緩沖夜的離子強度有關。

            長度為25base以下的引物,Tm計算公式為:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)

            對于更長的寡聚核苷酸,Tm計算公式為:

            Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) – 600/size         

            公式中,Size = 引物長度。

            8.引物(含修飾)的分子量是如何確定的?

            答:非修飾的引物的分子量(MW)在隨引物提供的報告單上可以找到。如果需要估計一個引物的分子量按每個堿基的平均分子量為324.5,引物的分子量=堿基數 x 堿基的平均分子量,或按下列公式計算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) +(Nx * Wx)+( NI* WI) +16* Ns–62. 

            NA, NG, NC, NT, NI分別為引物中堿基A或G或C或T或I的數量,WA, WG ,WC, WT, WI分別為引物中堿基A或G或C或T或I的分子量,Nmod,Wmod 分別為修飾基團的數目和分子量。對于混合堿基的分子量為混合堿基的分子量總合除以混合數,例如G+A混合的分子量為(313.21+329.21)/2 = 321.21。Ns為硫代數目,硫代每個位置增加分子量16。

            常規堿基分子量

            Base

            Molecular Weight 

            A

            313.21

            C

            289.18

            G

            329.21

            T

            304.19

            I

            314.2

            U

            290.17

            常規修飾基團分子量

            5’-Biotin

            405.45

            3’-TAMARA

            623.60

            5’-(6 FAM)

            537.46

            3’-Dabsyl

            498.49

            5’-HEX

            744.13

            3’-(6 FAM)

            569.46

            5’-TET

            675.24

            3’-Amino Modifier C3

            153.07

            5’-Cy5

            533.63

            3’-Amino Modifier C7

            209.18

            5’-Cy3

            507.59

            3’-Thiol Modifier C3

            154.12

            9.如何溶解引物?

            答:干燥后的引物質地非常疏松,開蓋前最好瞬時離心一下,或管垂直向上在桌面上敲敲,將引物粉末收集到管底。根據計算出的體積加入去離子無菌水或TE(pH8.0)緩沖液,室溫放置幾分鐘,振蕩助溶,離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水,因為有些蒸餾水的pH值比較低(pH4-5),引物在這種條件下不穩定。

            10.如何保存引物?

            答:引物合成后,經過一系列處理和純化步驟,旋轉干燥而成無色或白色絮狀干粉。

               粉:運輸時常溫運輸,-20℃可以保存一年。

            儲存液:配好后分裝成幾管,避免反復凍融,-20℃可以保存半年。

            工作液:常規使用,4℃保存,也可-20℃保存,但應避免反復凍融。

            修飾熒光引物:需要避光保存,盡快使用為宜。

            11.引物定量不準是怎么回事兒?

            答:我們偶爾收到用戶投訴定量不準的報告,出現這種情況的可能性有:

            1)定量錯誤、分裝錯誤、引物抽干或收樣過程中意外丟失。這種可能性有,但是很少,因為作為專業的引物合成公司,我們的生產人員都是經過嚴格的專業培訓,這種錯誤是要求謹慎避免甚至杜絕的。一般情況下,引物都有留樣備份,接到用戶投訴后,我們都會找出留樣重新定量,一般都沒有問題,如確實存在問題,則可安排重新準備一份。

            2)系統誤差,我們認為10%左右為允許誤差。使用過程中,引物工作濃度范圍很寬,定量上的少許偏差不影響實驗。

            3)用戶收到引物干粉時,打開引物管蓋前沒有離心或其他誤操作導致引物干粉部分丟失。

            4)用戶沒有能夠正確理解引物OD數的含義,沒有能夠正確使用分光光度計,特別是使用微量測定;用戶沒有將OD讀數,正確地轉換成母液中OD數。這種情況比較常見。

               例如,驗證標2OD引物量是否準確,簡單的做法是: 加入1ml水,徹底溶解混勻后,取100ul, 加入900ul水,用光徑為1cm的石英比色杯,波長260nm, 此時光吸收的讀數為0.2。

            12.最長可以合成多長的引物?

            答:我們合成過120base的引物,但是產率很低。除非需要,建議合成片段長度不要超過80base。引物越長,出現問題的概率就越大,按照目前的引物合成效率,大于80base的粗產品,全長引物的百分比不高,后續處理還有丟失很多,最后的產量是很低。

            13.為什么修飾引物的產量要比一般引物低,價格要高?

            答:主要因為是修飾單體穩定性較差,偶連時間長,效率低,最后得到的產量自然低于一般的引物。修飾引物通常需要PAGE或HPLC純化,純化過程損失大。修飾引物使用的原料是一般引物原料的幾百倍,所以產品的價格也高。

            14.引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題?

            答:連接反應需要引物的5’磷酸基團。如果需要將合成的引物退火直接連接相應的載體上,引物需要磷酸化。磷酸化的產物如果還不能連接載體上,需要檢查載體的酶切效果,需要改善引物退火的條件。SiRNA分子具有特殊的對稱結構,退火的難度較大,退火時需要提高退火溫度。

            15.如果測序發現引物突變,是否有補償?該如何處理?

            答:如果出現測序發現引物位置堿基錯誤的情況,我們可以免費重合一次,沒有其他任何補償或賠償,不承擔其他連帶責任,這是國際行規。原因我們在前面已提到,化學合成效率不可能達到100%。

            如果遇到這種情況,首先和我們聯系,我們會檢查合成序列是否和原始訂單一致,如果確認引物合成序列沒有輸錯,我們建議重新挑取克隆測序,您可能會找到正確克隆的。根據我們經驗,40個堿基以下的引物,測1-2個克隆就可以了;40個以上的特別是用于全片段拼接合成的,就需要多測一些了。一般情況下,每個克隆突變的位點都不一樣,正確的總是有的,就是如何找到它。您也可以要求我們將引物免費重合一次,不過重合的引物和第一次的引物一樣,都可能含突變,不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的幾率?;蚱唇舆^程中,如果發現一段區域突變點不多,就多測幾個,否則就重合一下引物。

            16.引物是經過PAGE純化的,為什么還有堿基缺失或插入?

            答:理論上分析型PAGE變性電泳,可以區分引物之間一個堿基的差別。但是如果客戶對長引物的量要求比較高,為保證引物的量,制備PAGE電泳,上樣量都是非常大,電泳時的條帶非常寬,帶與帶之間有重疊,分辨率已下降,電泳后割帶回收目的引物時,很難說不割到差別僅幾個堿基的引物。建議:減少OD數,引物遇到的問題可能就會少一些。

            17.為什么引物的OD260/OD280小于1.5 ?

            答: 需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過低一般是由于引物中C/T 的含量比較高所致。下表是一個20base 同聚體引物的OD260/OD280的比值,清楚表明OD260/OD280的比值與引物的堿基組成密切相關。

            A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions

            Base Composition

            A260/280

            5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3

            2.50

            5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3

            1.85

            5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3

            1.15

            5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3

            1.14

            5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3

            1.66

            18.同樣的OD用PAGE檢測,EB染色為什么深淺不一?

            答:通??梢杂?/span>EB染色的方法來判斷雙鏈DNA的量(如質粒DNA),因為EB可以嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA,由于堿基組成不同,形成二級結構的可能性不同,EB的染色程度也會有差異,比如Oligo(dT)等不形成二級結構,EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法來定量,而用紫外分光光度計檢測。

            19.如何檢測引物的純度?

            答:實驗室方便的做法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。取0.2-0.5OD的引物,用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和,上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性,二是增加樣品比重,容易加樣。600V電壓進行電泳,一定時間后(約2-3小時),剝膠,用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型,在主帶之下沒有雜帶,說明純度是好的。如果條件許可,也可以用銀染方式染色。

            21.已經溶解的引物,為什么原先使用正常,而過一段時間再使用就不好了?

            答:如果您溶解引物的水pH過低或污染了菌或核酸酶,會使引物降解。使用時沒有充分解凍混合,液體不均勻也可能會造成引物加入量不準確。建議分裝引物,避免反復凍溶。建議使用10mM Tris pH7.5緩沖液溶解引物,因為有些蒸餾水的pH值比較低(pH4-5), 引物在這種條件下不穩定。還有一種可能性是引物沒有問題,而是PCR使用材料特別是模板的質量與先前使用的不完全一致。

            22.引物是我們設計的,現在您擴不出來,我們要負責嗎?

            答:不承擔相關責任。我們為一些實驗經驗不足的客戶,免費設計引物,提供一定的便利。我們遵循一般的引物設計原則設計好引物之后都會發給您確認,而后再安排合成并保證引物質量。但是設計的引物是否能夠滿足您的實驗要求,一定擴增出您需要的基因片段,誰也不能100%保證。

            23.PCR擴增無目的片段是引物質量有問題嗎?

            答:PCR擴增無目的條帶或者非特異性擴增,影響因素是多方面的,需要耐心地分析,如模板結構與質量、反應條件、引物設計等等。當今發展出各色各樣的PCR擴增技術,各色各樣的高溫聚合酶,就是來解決PCR擴增中遇到的擴不出,擴增效率低的問題。如巢式PCR就是擴增拷貝數很低的基因片段。通過提高模板質量、優化反應條件等方面找到對策,或者有必要時重新設計引物,最好在實驗時設置對照來判定原因。如果您懷疑引物的問題,請您首先測定您溶解的引物的OD值,看實驗時加入的引物量是否正確。如果量是正常的,請您告訴我司您的引物編號,我們會復查留存樣品。如不明原因,我們免費為您重新合成一次。如果仍然不能擴增,請您查找其它原因。多數情況下我們復檢引物質量都沒有問題,因為我們在引物出售前已經嚴格把好質量關。

            24. 常用熒光染料參數

            染料

            Excitation 
            (激發波長, nm ) 

            Emission 

            (發射波長, nm )

            顏色

            6-FAM

            494

            518

            Yellow-green

            Fluorescein

            495

            520

            TET

            521

            536

            JOE

            520

            548

            Yellow

            HEX

            533

            559

            CY3

            550

            570

            Yellow-orange

            TAMRA

            544

            576

            ROX

            576

            601

            Orange

            Cy5

            650

            670

            Red

            注:關于猝滅基團的選擇,一般是報告基團的發射光在猝滅基團的吸收波長內。


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