引物合成常見問題

1.引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種,無論采用什么機器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環用時的多少。

（1） 去保護：加入Deblocking脫去堿基上5'- OH的保護基團 DMT ，獲得游離的 5'- OH； 

（2） 耦合：同時加入活化劑和新的堿基，新的堿基 5'- OH仍然被 DMT 保護，3' 端被活化與溶液中游離的 5'- OH發生耦合反應；

（3） 封閉：耦合反應中極少數 5'- OH沒有參加反應 ，用封閉試劑終止其后繼續發生反應；

（4） 氧化：加入氧化劑使其由核苷亞磷酸酯形成更穩定的核苷磷酸酯。

合成后處理：

切割與脫保護基：將合成好的寡核苷酸鏈從支持物上化學切割下來。常用新鮮的濃氨水來裂解CPG與初始核苷之間的酯鍵。斷裂下來的寡核苷酸帶有自由的3’羥基。

純化：根據所合成寡核苷酸的組成和應用來選定純化的方法。常用的純化方法有：C18、OPC、PAGE和HPLC。

定量：根據寡核苷酸在260nm處的紫外吸收來定量。

儲存：分裝抽干。

2.引物純化方式有哪些，如何選擇？

◆　C18柱脫鹽：又稱簡易反相柱，它對DNA有特異性的吸附，可以被有機溶劑溶解洗脫，但不會被水洗脫，所以能有效地去除鹽分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。實際上，它是一種脫鹽的作用。這種方法一般不會對普通PCR反應產生影響。對于需要用于測序、克隆的引物不能使用這個級別。    

◆　OPC純化： OPC純化是根據DNA保護基（DMT基）和樹脂間的親合力作用的原理進行純化目的DNA片段。OPC法純化的DNA純度大于95%。適用于45base以下引物的純化。

◆　PAGE純：  PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對DNA片段進行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大于95%，對長鏈Oligo DNA (大于45mer)的純化特別有效。 

◆　HPLC純化：HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對DNA片段進行純化。純度可以大于99%。主要用于短鏈和修飾引物的純化。該法的弱點是成本較高，批量生產效率不高。

◆　F-PAGE純化：利用高分子惰性聚合分子作為合成載體，合成縮合率較高，有效減少了失敗條帶。經過后續的脫鹽實驗，能夠去除銨鹽等雜質，適用于大部分實驗要求。F-Page純化具有合成效率及純度高，合成時間更短等顯著特點。

3.合成的引物5’端是否有磷酸化？

合成的引物5’為羥基，沒有磷酸基團。如果需要您可以用多核苷酸激酶進行5’端磷酸化，或者要求我們合成時直接在5’或3’端進行磷酸化，需要另外收費。

4.需要什么級別的引物？

答：根據實驗需要，確定訂購引物的純度級別。

5.需要合成多少OD數？

答：根據實驗目的確定。一般PCR擴增，2 OD引物，可以做200-500次50ul標準PCR反應。如果是做基因拼接或退火后做連接，1 OD就足夠了。

6.如何計算引物的濃度？

答：引物保存在高濃度的狀況下比較穩定。一般情況下，我們建議將引物的濃度配制成100pmol/ul，稱為保存濃度，而引物的工作濃度一般配制成10-50pmol/ul。加水的體積（微升）可直接參照合成報告單上推薦的體積，也可按下列方式計算：

V (微升)= OD數x 33 x 10000 /引物的分子量

引物的分子量可以從合成報告單上獲得。注意：1 OD₂₆₀= 33 ug/ml。 

溶解前您需要核對合成報告單和引物標簽上的引物OD數是否一致。如果不一致，請和我們聯系。我們可以根據生產記錄查到實際產量是多少。

7.如何計算引物的Tm值？

答：引物設計軟件都可以給出Tm，與引物長度、堿基組成及所使用緩沖夜的離子強度有關。

長度為25base以下的引物，Tm計算公式為：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)

對于更長的寡聚核苷酸，Tm計算公式為：

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) – 600/size^＊         

＊公式中，Size = 引物長度。

8.引物（含修飾）的分子量是如何確定的？

答：非修飾的引物的分子量（MW）在隨引物提供的報告單上可以找到。如果需要估計一個引物的分子量按每個堿基的平均分子量為324.5，引物的分子量=堿基數 x 堿基的平均分子量，或按下列公式計算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) ＋(Nx * Wx)+( NI* WI) +16* Ns–62. 

NA, NG, NC, NT, NI分別為引物中堿基A或G或C或T或I的數量，WA, WG ,WC, WT, WI分別為引物中堿基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分別為修飾基團的數目和分子量。對于混合堿基的分子量為混合堿基的分子量總合除以混合數，例如G+A混合的分子量為（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns為硫代數目，硫代每個位置增加分子量16。

常規堿基分子量

常規修飾基團分子量

9.如何溶解引物？

答：干燥后的引物質地非常疏松，開蓋前最好瞬時離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末收集到管底。根據計算出的體積加入去離子無菌水或TE(pH8.0)緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5）,引物在這種條件下不穩定。

10.如何保存引物？

答：引物合成后，經過一系列處理和純化步驟，旋轉干燥而成無色或白色絮狀干粉。

干   粉：運輸時常溫運輸，-20℃可以保存一年。

儲存液：配好后分裝成幾管，避免反復凍融，-20℃可以保存半年。

工作液：常規使用，4℃保存，也可-20℃保存，但應避免反復凍融。

修飾熒光引物：需要避光保存，盡快使用為宜。

11.引物定量不準是怎么回事兒？

答：我們偶爾收到用戶投訴定量不準的報告，出現這種情況的可能性有：

（1）定量錯誤、分裝錯誤、引物抽干或收樣過程中意外丟失。這種可能性有，但是很少，因為作為專業的引物合成公司，我們的生產人員都是經過嚴格的專業培訓，這種錯誤是要求謹慎避免甚至杜絕的。一般情況下，引物都有留樣備份，接到用戶投訴后，我們都會找出留樣重新定量，一般都沒有問題，如確實存在問題，則可安排重新準備一份。

（2）系統誤差，我們認為10%左右為允許誤差。使用過程中，引物工作濃度范圍很寬，定量上的少許偏差不影響實驗。

（3）用戶收到引物干粉時，打開引物管蓋前沒有離心或其他誤操作導致引物干粉部分丟失。

（4）用戶沒有能夠正確理解引物OD數的含義，沒有能夠正確使用分光光度計，特別是使用微量測定；用戶沒有將OD讀數，正確地轉換成母液中OD數。這種情況比較常見。

   例如，驗證標2OD引物量是否準確，簡單的做法是： 加入1ml水，徹底溶解混勻后，取100ul, 加入900ul水，用光徑為1cm的石英比色杯，波長260nm, 此時光吸收的讀數為0.2。

12.最長可以合成多長的引物？

答：我們合成過120base的引物，但是產率很低。除非需要，建議合成片段長度不要超過80base。引物越長，出現問題的概率就越大，按照目前的引物合成效率，大于80base的粗產品，全長引物的百分比不高，后續處理還有丟失很多，最后的產量是很低。

13.為什么修飾引物的產量要比一般引物低，價格要高?

答：主要因為是修飾單體穩定性較差，偶連時間長，效率低，最后得到的產量自然低于一般的引物。修飾引物通常需要PAGE或HPLC純化，純化過程損失大。修飾引物使用的原料是一般引物原料的幾百倍，所以產品的價格也高。

14.引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題？

答：連接反應需要引物的5’磷酸基團。如果需要將合成的引物退火直接連接相應的載體上，引物需要磷酸化。磷酸化的產物如果還不能連接載體上，需要檢查載體的酶切效果，需要改善引物退火的條件。SiRNA分子具有特殊的對稱結構，退火的難度較大，退火時需要提高退火溫度。

15.如果測序發現引物突變，是否有補償？該如何處理？

答：如果出現測序發現引物位置堿基錯誤的情況，我們可以免費重合一次，沒有其他任何補償或賠償，不承擔其他連帶責任，這是國際行規。原因我們在前面已提到，化學合成效率不可能達到100%。

如果遇到這種情況，首先和我們聯系，我們會檢查合成序列是否和原始訂單一致，如果確認引物合成序列沒有輸錯，我們建議重新挑取克隆測序，您可能會找到正確克隆的。根據我們經驗，40個堿基以下的引物，測1-2個克隆就可以了；40個以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個克隆突變的位點都不一樣，正確的總是有的，就是如何找到它。您也可以要求我們將引物免費重合一次，不過重合的引物和第一次的引物一樣，都可能含突變，不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的幾率?；蚱唇舆^程中，如果發現一段區域突變點不多，就多測幾個，否則就重合一下引物。

16.引物是經過PAGE純化的，為什么還有堿基缺失或插入？

答：理論上分析型PAGE變性電泳，可以區分引物之間一個堿基的差別。但是如果客戶對長引物的量要求比較高，為保證引物的量，制備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時，很難說不割到差別僅幾個堿基的引物。建議：減少OD數，引物遇到的問題可能就會少一些。

17.為什么引物的OD₂₆₀/OD₂₈₀小于1.5 ？

答： 需要指出的是OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值不能用來衡量引物的純度。OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值過低一般是由于引物中C/T 的含量比較高所致。下表是一個20base 同聚體引物的OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值，清楚表明OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值與引物的堿基組成密切相關。

18.同樣的OD用PAGE檢測，EB染色為什么深淺不一？

答：通?？梢杂?/span>EB染色的方法來判斷雙鏈DNA的量(如質粒DNA)，因為EB可以嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA，由于堿基組成不同，形成二級結構的可能性不同，EB的染色程度也會有差異，比如Oligo(dT)等不形成二級結構，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法來定量，而用紫外分光光度計檢測。

19.如何檢測引物的純度？

答：實驗室方便的做法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行電泳，一定時間后(約2-3小時)，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用銀染方式染色。

21.已經溶解的引物，為什么原先使用正常，而過一段時間再使用就不好了？

答：如果您溶解引物的水pH過低或污染了菌或核酸酶，會使引物降解。使用時沒有充分解凍混合，液體不均勻也可能會造成引物加入量不準確。建議分裝引物，避免反復凍溶。建議使用10mM Tris pH7.5緩沖液溶解引物，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5）, 引物在這種條件下不穩定。還有一種可能性是引物沒有問題，而是PCR使用材料特別是模板的質量與先前使用的不完全一致。

22.引物是我們設計的，現在您擴不出來，我們要負責嗎？

答：不承擔相關責任。我們為一些實驗經驗不足的客戶，免費設計引物，提供一定的便利。我們遵循一般的引物設計原則設計好引物之后都會發給您確認，而后再安排合成并保證引物質量。但是設計的引物是否能夠滿足您的實驗要求，一定擴增出您需要的基因片段，誰也不能100%保證。

23.PCR擴增無目的片段是引物質量有問題嗎？

答：PCR擴增無目的條帶或者非特異性擴增，影響因素是多方面的，需要耐心地分析，如模板結構與質量、反應條件、引物設計等等。當今發展出各色各樣的PCR擴增技術，各色各樣的高溫聚合酶，就是來解決PCR擴增中遇到的擴不出，擴增效率低的問題。如巢式PCR就是擴增拷貝數很低的基因片段。通過提高模板質量、優化反應條件等方面找到對策，或者有必要時重新設計引物，最好在實驗時設置對照來判定原因。如果您懷疑引物的問題，請您首先測定您溶解的引物的OD值，看實驗時加入的引物量是否正確。如果量是正常的，請您告訴我司您的引物編號，我們會復查留存樣品。如不明原因，我們免費為您重新合成一次。如果仍然不能擴增，請您查找其它原因。多數情況下我們復檢引物質量都沒有問題，因為我們在引物出售前已經嚴格把好質量關。

24. 常用熒光染料參數

注：關于猝滅基團的選擇，一般是報告基團的發射光在猝滅基團的吸收波長內。