引物和探針的實驗要求
PCR是分子生物學實驗中最常使用的實驗方法。引物和探針的設計是實驗者進行PCR擴增時必須要了解的一個知識點。
1. 由于引物原因導致PCR擴增有非特異性擴增
引物特異性差是PCR有非特異性擴增的一個主要原因。特別是模板為基因組等復雜模板時,對引物設計有較高要求??梢酝ㄟ^:
1)提高退火溫度;
2)選擇模板其它區域重新設計引物;
3)如果是做染料法熒光定量PCR的,引物純化方式要為Page,HPLC等純化級別。
2. PCR擴增后有引物二聚體
染料法熒光定量PCR對引物設計上要求較高。
1)引物結構上不能有較嚴重的二聚體及發夾結構;
2)PCR體系中引物濃度一般在0.1um-1um,一般為0.2um。如果引物濃度要求更低,可以嘗試在0.05um-0.1um;
3)提高退火溫度。.
3. 熒光定量PCR的引物設計要求
1)引物GC含量盡可能在40%-60%,Tm值最好取60℃左右;
2)避免引物自身或與引物之間形成4個或以上連續堿基配對,同時沒有形成發夾結構;
3)引物長度在20-30bp;
4)目的片段長度一般設計為100-200bp;
5)引物特異性要較高。
4. Taqman探針的設計要求
1)Tm值最好在65-70℃(MGB探針可以降低Tm值);
2)探針的5’端應避免堿基G;
3)探針長度最好在20-30bp;
4)探針盡可能的靠近引物位置;
5)保證探針的高度特異性。